与此同时，1886年4月，弗洛伊德正式开业行医。布洛伊尔主张开始收费要低些，甚至穷人可以免费治疗，弗洛伊德听了很泄气。尽管做了广告宣传，挂上了金字招牌，但头几个月患者寥寥无几，收入极其有限。由于玛莎处处表现出忍让、俭朴和顾全大局，弗洛伊德在生活上的困难才不至于影响他的工作。随着弗洛伊德事业的发展，他不仅个人享誉世界，而且家庭幸福美满。但这段贫困的生活他们却永远没有忘记。
（二）开展神经组织学与神经病理学研究
在维也纳综合医院三年工作中，虽然弗洛伊德连续地从该院的一个部门转到另一个部门，但他始终坚持两手抓，边工作，边研究。其中，工作的重点始终是神经系统的疾病，而业余时间研究的重点则是有关神经系统方面的生理结构和功能。
过去和布吕克教授在一起时主要从事最低等的鱼类的脊椎研究，曾发表《鳗鱼的生殖腺的形态与构造》（1877）、《八目鳗神经节细胞》（1878）、《蝲蛄的神经纤维及神经细胞的结构》（1882）、《神经系统的基本结构》（1882）等论文。
现在开始转向人类中枢神经系统的研究。弗洛伊德在著名神经学家梅纳特和布吕克的领导下，先后研究了神经纤维、神经细胞、神经错乱，以及他独自研究麻醉神经的可卡因，均取得重要的成果。